2021年1月24日
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名称:
 
   
   
   
 
  产品名称: 禽流感病毒H5(Re-11株)血凝抑制试验抗原、阳性血清
  产品编号: HWK001
  产品规格: 2ml/瓶
     
 
特效与功效:
 

禽流感病毒H5亚型(Re-11株)血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书

仅供兽医诊断使用

[兽药名称]

通用名称:禽流感病毒H5亚型(Re-11株)血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清

商品名称:无

英文名称:Avian Influenza VirusH5 Subtype (Strain Re-11) Hemagglutination Inhibition Test Antigen, Positive

Sera and Negative Sera

汉语拼音: Qinliuganbingdu H5 Yaxing (Re-11 zhu) Xueningyizhishiyan Kangyuan, Yangxingxueqing Yu

Yinxingxueqing

[主要成分与含量]

抗原为灭活的H5亚型(Re-11株,2.3.4.4d分支)禽流感病毒,血凝(HA)效价不低于1 : 128。测定鸡血清时,使用鸡禽流感病毒H5亚型(Re-11株)阳性血清,血凝抑制(HI)抗体效价不低于1:128;使用鸡禽流感病毒H5亚型阴性血清,HI抗体效价不高于1 : 4。测定鸭血清时,使用鸭禽流感病毒H5亚型(Re-11株)阳性血清,HI抗体效价不低于1 : 160;使用鸭禽流感病毒H5亚型阴性血清,HI抗体效价不高于1:10。测定鹅血清时,使用鹅禽流感病毒H5亚型(Re-11株)阳性血清,HI抗体效价不低于1:160;使用鹅禽流感病毒H5亚型阴性血清,HI抗体效价不高于1:10。

[性状]

抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块;阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离,加稀释液后迅速溶解。

[作用与用途]

用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型(2.3.4.4d分支)抗体。

[用法与判定]

1材料

1.196孔V型(90度)微量反应板、单道及多道微量移液器(配有吸头)、加样槽、吸管、烧杯等。

1.2 pH值7.0~7.2, 0.01mol/L的PBS按照如下 方法配制或购买商品化产品,PBS-经使用,于2~8°C保存不超过3周。PBS配制方法:秤量NaCl 80g、KCl 2g、十二水磷酸氢二钠36.3g、磷酸二氢钾2.4g,溶解于ddH,0中,并定容至10L,用氢氧化钠或盐酸调pH值至7.0~7.2,最后121°C灭菌30分钟或过滤后使用。

1.3阿氏(Alsevers)液称 葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g,加蒸馏水至100ml,加热溶解后调pH值至6.1, 69Kpa 15min高压灭菌,2~8°C保存备用。

1.4 1%鸡红细胞悬液采取2~4只 2~6月龄SPF鸡的血液,与等量阿氏液混合,然后用PBS (0.01mol/L, pH值7.0~7.2,下同)洗涤3~4次,每次以1500r/min离心5~ 10分钟,将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。

1.5抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量,用PBS溶解。

2操作术式

2.1血凝(HA)试验

2.1.1在V型微量反应板中,每孔加0.025ml PBS。

2.1.2第1孔加0.025ml抗原,反复抽打3~5次混匀。

2.1.3从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔,混匀后吸取0.025ml加入第3孔,如此进行2倍系列稀释至第11孔,从第11孔吸取0.025ml弃去。

2.1.4每孔加0.025ml PBS。

2.1 5每孔加入0.025ml 1% (V/V)鸡红细胞悬液。

2.1.6结果判定将反应板在振荡器上震荡1~2分钟或轻扣反应板混合反应物,置室温20~30分钟或置2~8°C 45~60分钟,当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

2.2血凝抑制(HI)试验(鸭、鹅血清在检测血清时需要进行前处理,参考方法见注意事项)

2.2.1根据HA试验测定的效价,如果抗原凝集价测定结果为1 : 1024 (举例),4个血凝单位(即4 HAU)=1024/4=256(即1 : 256)。取PBS 9.0ml,加抗原1.0ml,即成1 : 10稀释,将1 : 10稀释液1.0ml加入到24.6 ml PBS中,使最终浓度为1 : 256。

2.2.2四个单位血凝单位检测检查4HAU的血凝价是否准确,应将配制的1:256稀释液进行系列稀释,使最终稀释度为1: 2、1: 3、1:4、1: 5、1 : 6和1 : 7。然后,从每一稀释度中取0.025ml,加入PBS 0.025ml,再加入1%鸡红细胞悬液0.025ml,混匀。将血凝板置室温20~40分钟或置2~8°C40~60分钟,如果配制的抗原液为4HAU,则1 : 4稀释度将给出凝集终点;如果4 HAU高于4个单位,可能1 : 5或1 : 6为终点;如果较低,可能1:2或1:3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整,使工作液确为4HAU。

2.2.3第2~ 11孔加入0.025ml PBS,第12孔加入0.05ml PBS。

2.2.4第1、2孔加入0.025ml血清;第2孔血清与PBS充分混匀后吸0.025ml于第3孔,依次2倍系列稀释至第10孔,

从第10孔吸取0.025ml弃去。

2.2.5第1~ 11孔均加入0.025ml的4HAU抗原,在室温(20~25°C)下静置至少20分钟或2~8°C至少60分钟。2.2.6每孔加入0.025ml 1% (V/V)的鸡红细胞悬液,震荡混匀;在室温(20~25°C)下静置20~40分钟或2~8°C

40~60分钟,对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。

3结果判定以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。检测鸡血清时,当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度,阴性对照血清抗体效价不高于1:4时,试验方可成立;被检血清HI抗体效价不高于1:8判为阴性,不低于1:16判为阳性。检测鸭和鹅血清时,当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度,阴性对照血清效价不高于1:10时,试验方可成立;被检血清HI抗体效价不高于1 : 10判为阴性,高于1 : 10(不含1 : 10)判为阳性。

[注意事项]

(1)HA和HI试验影响因素甚多,应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头,同时应严格控制作用温度和时间。

(2)准确配制红细胞悬液,使用时应随时振摇。

(3)用pH值7.0~7.2的PBS (0.01mol/L)作为稀释液。

(4)抗原和阴、阳性血清若有污染,应废弃。

(5)准确配制4HAU抗原,使用前需进行滴定,滴定好的抗原应在2小时内用完。

(6)抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2~8°C保存不超过1个月。

(7)同-一亚型不同毒株的HI试验抗原,若抗原性存在差异,则检测同一血清的HI抗体效价不同。

(8)鸭、鹅血清一般需进行非特异性凝集抑制素的处理,并分别以鸭、鹅阳性血清、阴性血清作为HI试验对照血清。处理参考如下方法,可根据本实验室实际情况选择使用。

①胰酶-加热-高碘酸盐法

A.取0.3ml血清,加0.15ml胰酶溶液(8 mg/ml: 200mg的P 250胰酶溶解于25mt的0.01mol/L, pH值7.0~7.2的PBS中,混匀,过滤除菌,分装并在一15°C以下保存,保存期6个月),混匀后,在56°C水浴灭活30分钟后冷却至室温。

B.再加入0.9ml高碘酸钾(将230mg的KI04用0.01mol/L, pH值7.0~7.2的PBS, 定容至100ml,过滤除菌后避光室温保存,保存期1周),混合,室温孵育15分钟。

C.再加入0.9ml的丙三醇盐溶液(1ml的丙三醇加入到99ml的0.01mol/L, pH值7.0~7.2的PBS中,混匀,过滤除菌,室温保存),混合,室温孵育15分钟。

D.最后加入0.75ml生理盐水,混匀,置4°C保存备用。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。

②受体破坏酶(RDE)处理法

A.1体积血清(50μl) ,加4体积RDE (200μl) ,37°C水浴18小时(过夜)。

B.再加入5体积(250μl)的1.5%浓度的柠檬酸钠,混匀,置56°C水浴30分钟(以破坏残余的RDE活性)。

C.将1体积的50%的红细胞加入到10体积RDE处理的血清中(50μl红细胞+ 500μl血清),震荡混勻后4°C放置1小时,期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次。

D.1000g离心10min,小心吸取上层上清,用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。

[规格] (1) 1ml/瓶(2) 2ml/瓶

[包装] (1) 10瓶/盒(2)24盒/箱 (3) 60盒/箱

[贮藏与有效期] - 15°C以下保存,有效期为24个月。

[批准文号]兽药临字080018861

[生产企业]哈尔滨维科生物技术有限公司

哈尔滨维科生物技术有限公司

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